食品安全国家标准 食品用菌种安全性评价程序

A.5.1 腹腔注射

A.5.1.1 菌种活化：目前我国食品用细菌菌种主要是双歧杆菌属、乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属等，除这些属以外，其他菌种在以下描述中均使用“其他细菌”。根据送检菌种的保存状态，将双歧杆菌、乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属接种含有半胱氨酸盐酸盐的 MRS肉汤培养基、其他细菌接种 LB肉汤培养基(或适于该菌生长的最适液体培养基中)活化(或传代使活力达到最佳)，并置适宜的培养条件(包括培养温度、湿度、厌氧、需氧、微需氧等)下培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异)，确认为纯培养后备用。

A.5.1.2 菌悬液制备：将 A.5.1.1中活化的双歧杆菌接种含有半胱氨酸盐酸盐的 MRS琼脂平板或含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板;乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属接种含有半胱氨酸盐酸盐的 MRS琼脂平板，其他细菌接种 LB琼脂平板或适应于该菌生长的最适培养基琼脂平板，在规定的适宜培养条件(包括培养温度、湿度、厌氧、有氧、微需氧等)下培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异)后，刮取平板上的菌落，将其悬浮于无菌生理盐水中，充分混匀后，用适量无菌生理盐水调整菌悬液浊度，使最终菌悬液中的菌浓度为5.0×107 CFU/mL，用于小鼠腹腔注射。

A.5.1.3 腹腔注射：小鼠不少于40只，雌雄各半，随机分成4组(每组不少于10只)，包括雄性小鼠无菌生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠无菌生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组。注射量为0.2mL/只，即受试物组每只小鼠注射菌量至少1.0×107 CFU。

A.5.1.4 动物观察：动物腹腔注射后每天观察1次，连续观察至少21d。观察并记录小鼠皮肤和毛、眼睛和黏膜、呼吸情况、肢体活动、行为方式等有无异常。特别注意观察是否出现震颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏迷等现象。试验前称量并记录所有小鼠的体重，试验结束后称量并记录所有存活小鼠的体重。对于试验期间死亡的小鼠，尽可能精确记录小鼠的死亡时间，同时称重并记录。

A.5.2 经口灌胃

A.5.2.1 菌数预估

无菌吸取 A.5.1.1的培养液，分别加至2个无菌离心管中，每管1mL，3000g 离心10min，弃去上清液后，用适量无菌生理盐水调整菌悬液浊度，使最终菌悬液中菌的浓度分别不低于2.5×10⁸ CFU/mL和1.25×10⁹ CFU/mL，并分别记录每毫升培养液离心后所得沉淀物中细菌数调整至2.5×10⁸ CFU/mL和1.25×10⁹ CFU/mL时需加入的无菌生理盐水的体积(mL)。

A.5.2.2 菌悬液制备

A.5.2.2.1 培养上清液的制备：根据受试动物总数和每只动物的灌胃体积计算所需要的受试菌种培养液用量，吸取 A.5.1.1培养液，将培养液一分为二，3000g 各离心10min后，将上清液分别转至100mL无菌量筒中，1份上清液用于菌悬液原液的制备，另1份上清液冷冻浓缩至原体积的1/5，作为5倍浓缩上清液，备用。

A.5.2.2.2 菌悬液原液的制备：按照 A.5.2.1中获得的细菌终浓度达到2.5×108 CFU/mL所需要的生理盐水体积，根据离心的培养物体积，按相同比例加入 A.5.2.2.1获得的上清液，调整离心后的沉淀物使其细菌数达到2.5×108 CFU/mL(上清液量不够时可用空白培养基补齐)。

A.5.2.2.3 5倍浓缩菌悬液的制备：按照 A.5.2.1中获得的细菌终浓度达到1.25×109 CFU/mL所需要的生理盐水体积，根据离心的培养物体积，按相同比例加入 A.5.2.2.1获得的5倍浓缩上清液，调整离心后的沉淀物使其细菌数达到1.25×109 CFU/mL。

A.5.2.3 灌胃

小鼠不少于80只，雌雄各半，随机分成8组(每组不少于10只)，包括雄性小鼠培养基对照组、雄性小鼠菌悬液组、雄性小鼠5倍浓缩培养基对照组、雄性小鼠5倍浓缩菌悬液组、雌性小鼠培养基对照组、雌性小鼠菌悬液组、雌性小鼠5倍浓缩培养基对照组、雌性小鼠5倍浓缩菌悬液组。各组均以20mL/kg体重的体积给小鼠灌胃，使受试物组每只小鼠灌胃菌量分别为1.0×10⁸ CFU(原液组)和5.0×10⁸ CFU(5倍浓缩液组)，连续灌胃3d。首次灌胃前动物禁食过夜(16h)，灌胃后3h~4h喂食。

A.5.2.4 观察

动物经口灌胃后每天观察1次，至少连续观察21d，观察指标同 A.5.1.4。

A.6 结果与报告

对 A.5.1和 A.5.2的动物试验结果进行统计学分析和综合评价，包括：

a) 受试物对动物一般健康情况有无不良影响;

b) 受试物对动物体重等指标的影响;

c) 受试物组动物死亡情况;

d) 对受试物组和相应对照组小鼠的体重分别进行独立样本t检验，检验标准为α=0.05。若受试物组动物在试验期间未出现中毒症状或死亡，且体重等指标与对照组相比差异无统计学意义，即可判定该菌种无致病性;若受试物组动物在试验期间出现中毒症状或死亡，或试验期间体重等指标与对照组相比有显著性差异，即可判定该菌种具有致病性。