附录 B 食品用丝状真菌的致病性试验方法
B.1 范围 本方法规定了食品用丝状真菌的致病性试验方法。 本方法适用于食品用丝状真菌的致病性评价。
B.2 设备和材料 除微生物实验室常规设备外，其他设备和材料如下。 B.2.1 恒温培养箱：28 ℃±1 ℃。 B.2.2 电子天平：感量为0.1g。 B.2.3 锥形瓶：容量为500mL。 B.2.4 无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。 B.2.5 显微镜：10×~100×。 B.2.6 微量移液器及配套吸头：量程为100μL~1000μL 。 B.2.7 血球计数板。 B.2.8 注射器：量程为100μL~1000μL。 B.2.9 小鼠灌胃针头。 B.2.10 温湿度计。温度计允许误差：±1 ℃，湿度计允许误差：±3% RH。 B.2.11 接种钩。 B.2.12 球磨仪或功能相当的仪器。 B.2.13 无菌培养皿：直径90mm。
B.3 培养基和试剂 B.3.1 无菌生理盐水：见 A.3.1。 B.3.2 麦芽汁琼脂平板：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121 ℃高压灭菌15min，制备麦芽汁琼脂平板，备用。 B.3.3 马铃薯葡萄糖琼脂平板：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121 ℃高压灭菌15min，制备马铃薯葡萄糖琼脂平板，备用。 如菌种在上述2种培养基上的生长状态和产孢子量均不理想，可选用适于该菌种生长和产孢的其他培养基。
B.4 实验动物 见 A.4。
B.5 操作步骤 对于国内外均无使用历史的菌种，或国内外虽有使用历史，但对人和动物健康有不良影响记载或报道的菌种，必须使用腹腔注射和经口灌胃2种途径给予动物受试物，以评价受试物不同给予途径对动物的致病性。 对于国内外有使用历史且使用过程中未发现对人和动物健康有不良影响的菌种，可选择经口灌胃单一途径给予动物受试物，以评价受试物对动物的致病性。 B.5.1 腹腔注射 B.5.1.1 菌种活化 将送检菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板(红曲霉接种于麦芽汁琼脂平板)或适于该菌生长的最适培养基中，并置于适宜的培养条件下(包括培养温度、湿度、光照、通气量等)培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异)，确认为纯培养后备用。 B.5.1.2 菌悬液制备 B.5.1.2.1 产孢子量大的菌种：将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板(红曲霉属菌种接种麦芽汁琼脂平板)或适于菌种生长的培养基平板，28 ℃±1 ℃培养7d~14d后，挑取平板上的孢子，将其悬浮于无菌生理盐水中，充分混匀后，用血球计数板计数孢子浓度，并用适量无菌生理盐水调整，使其最终浓度不低于5.0×107 CFU/mL。 B.5.1.2.2 产孢子量少或不产孢子的菌种：将菌种接种于适宜的培养基上，28 ℃±1 ℃下培养7d~14d或在适宜的诱导产孢条件下培养一定时间后，挑取平板上的菌丝体及孢子，用球磨仪(或其他功能相当的仪器)将菌丝体磨碎，并用生理盐水重悬后，用血球计数板计数，并用适量无菌生理盐水调整，使菌悬液中菌丝体片段数/孢子的最终浓度不低于5.0×107 CFU/mL。 B.5.1.3 腹腔注射 小鼠不少于40只，雌雄各半，随机分成4组(每组不少于10只)，包括雄性小鼠生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组，每只小鼠注射0.2mL，即受试物组每只小鼠注射的菌量至少为1.0×107 CFU。 B.5.1.4 动物观察 动物腹腔注射后每天观察1次，至少连续观察21d，观察指标同 A.5.1.4。 B.5.2 经口灌胃 B.5.2.1 菌悬液制备：除制备的菌悬液中真菌孢子/菌丝体片段的浓度不低于2.5×108 CFU/mL外，其他操作步骤同 B.5.1.2。 B.5.2.2 灌胃：小鼠不少于40只，雌雄各半，随机分成4组(每组不少于10只)，包括雄性小鼠生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组，各组均以20mL/kg体重的体积 给小鼠灌胃1次，使受试物组每只小鼠灌胃菌量为1.0×108 CFU，灌胃前禁食过夜(16h)，灌胃后3h~4h喂食。 B.5.2.3 观察：动物经口灌胃后每天观察1次，至少连续观察21d，观察指标同 A.5.1.4。
B.6 结果与报告 对 B.5.1和 B.5.2的动物试验结果进行统计学分析和综合评价，内容同 A.6。 |
