附录 F 食品用真菌产真菌毒素能力测定方法
F.1 范围 本方法规定了食品用真菌产真菌毒素能力的测定方法。 本方法适用于食品用真菌在试验条件下的产毒能力的测定，对培养物中毒素的测定，按照我国、国际组织及相关国家规定的标准检测方法进行。 F.2 设备和材料 除微生物实验室常规设备外，其他设备与材料如下。 F.2.1 恒温培养箱：温度范围(5 ℃±1 ℃)~(42 ℃±1 ℃)。 F.2.2 电子天平：感量分别为0.1g和0.001g。 F.2.3 锥形瓶：容量为250mL、500mL、1000mL。 F.2.4 显微镜：10×~100×。 F.2.5 微量移液器及配套吸头：量程为100μL~1000μL。 F.2.6 生物安全柜。 F.2.7 无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。 F.2.8 无菌量筒：容量100mL~1000mL。 F.2.9 温湿度计。温度计允许误差：±1 ℃，湿度计允许误差：±3% RH。 F.2.10 接种针。 F.2.11 分离针。 F.2.12 无菌试管：16mm×160mm。 F.2.13 无菌培养皿：直径90mm。 F.2.14 载玻片。 F.2.15 盖玻片。
F.3 培养基及其制备 对能够产生毒素的食品用真菌菌种，应在多种基质和条件下(单品种固体、多品种固体复合、不同成分液体组合等)进行产毒试验，并进行有毒活性代谢产物真菌毒素含量的检测。 F.3.1 菌种活化用固体培养基 F.3.1.1 麦芽汁琼脂：同 B.3.2。 F.3.1.2 马铃薯葡萄糖琼脂：同 B.3.3。 F.3.1.3 查氏培养基：商品化培养基按照产品说明配制，加热充分溶解后分装，121 ℃高压灭菌15min后备用。 F.3.2 产毒用培养基 以下培养基中 F.3.2.1~F.3.2.7为液体培养基，F.3.2.8~F.3.2.11为固体培养基。 F.3.2.1 查氏酵母提取物(浸粉)培养基：K2HPO41g、10倍查氏浓缩液10mL、酵母提取物(浸粉)5g、蔗糖30g，用1000mL蒸馏水溶解后，分装至250mL锥形瓶中，每瓶100mL，121 ℃高压灭菌15min后备用。 F.3.2.2 查氏酵母提取物(浸粉)再加2%蔗糖培养基：K2HPO41g、10倍查氏浓缩液10mL、酵母提取物(浸粉)5g、蔗糖50g，用1000mL蒸馏水溶解后，分装至250mL锥形瓶，每瓶100mL，121 ℃高压灭菌15min后备用。 F.3.2.3 查氏酵母提取物(浸粉)加0.5% NaCl培养基：K2HPO41g、10倍查氏浓缩液10mL、酵母提取物(浸粉)5g、蔗糖30g、NaCl5g，用1000mL蒸馏水溶解后，分装至250mL锥形瓶，每瓶100mL，121℃高压灭菌15min后备用。 F.3.2.4 大米粉玉米浸出液培养基(rice corn steep medium，RC)：大米粉5g、玉米浸出液4g、ZnSO4·7H2O0.001g、CuSO4·5H2O0.05g，用1000mL蒸馏水溶解后，分装至250mL锥形瓶，每瓶100mL，121 ℃高压灭菌15min后备用。 F.3.2.5 马铃薯葡萄糖肉汤培养基：按产品说明书要求称取商品化马铃薯葡萄糖肉汤培养基，加入1000mL蒸馏水溶解后分装至250mL锥形瓶，每瓶100mL，121 ℃高压灭菌15min后备用。 F.3.2.6 酵母提取物(浸粉)蔗糖(yeast extract sucrose，YES)液体培养基：酵母提取物(浸粉)10g、蔗糖50g，用1000mL蒸馏水溶解后，调节pH 至7.0，分装至250mL锥形瓶，每瓶100mL，121℃高压灭菌15min后备用。 F.3.2.7 麦芽汁培养基：取未经发酵、未加酒花的啤酒生产用麦芽汁，分装至250mL 锥形瓶中，每瓶100mL，121 ℃高压灭菌15min后备用。 F.3.2.8 大米培养基：取大米20g，置于500mL或1000mL锥形瓶中，根据不同菌种产生毒素的湿度要求，用蒸馏水调整培养基的水分及pH(具体数值视菌株产毒特性要求而异)，121℃高压灭菌20min，冷却后手心击拍瓶体将结块的米粒打散，之后每日121 ℃高压灭菌20min1次，连续灭菌3d，每次高压灭菌冷却后均应拍击打散，备用。 F.3.2.9 玉米培养基：取粉碎后的玉米渣20g(粒径0.2mm~0.5mm)至500mL或1000mL锥形瓶中，根据不同菌种产生毒素的湿度要求，用蒸馏水调整培养基的水分及pH(具体数据视菌种产毒特性要求而异)，121℃高压灭菌20min，冷却后手心击拍瓶体将结块的玉米渣粒打散，之后每日121℃高压灭菌20min1次，连续灭菌3d，每次高压灭菌冷却后均应拍击打散，备用。 F.3.2.10 麦麸培养基：取麦麸20g至500mL或1000mL锥形瓶中，根据不同菌种产生毒素的湿度要求，用蒸馏水调整培养基的水分及pH(具体数据视菌种产毒特性要求而异)，121℃高压灭菌20min，冷却后手心击拍瓶体将结块的麦麸打散，之后每日121 ℃高压灭菌20min1次，连续灭菌3d，每次高压灭菌冷却后均应拍击打散，备用。必要时可用全麦粒替代麦麸进行产毒试验。 F.3.2.11 固体复配培养基：大米、玉米渣、麦麸(或全麦粒)以1∶1∶1比例混合后，取20g至500mL或1000mL锥形瓶中，根据不同菌种产生毒素的湿度要求，用蒸馏水调整培养基的水分及pH(具体数据视菌种产毒特性要求而异)，121℃高压灭菌20min，冷却后手心击拍瓶体将结块的培养基打散，之后每日121 ℃高压灭菌20min1次，连续灭菌3d，每次高压灭菌冷却后均应拍击打散，备用。 在对菌种进行产毒试验时，所选的产毒培养基除了生产用基质外，还应从以上所列培养基中至少选择3种液体培养基、3种固体培养基和含有3种固体培养基成分的固体复配培养基。
F.4 操作步骤 F.4.1 产毒试验前对送检菌种的处理 送检菌种必须为纯菌种，转种到适宜的培养基斜面后，28 ℃±1 ℃培养5d~7d，确证为活的纯培养物后方可进行产毒试验。转种用培养基曲霉属一般选用查氏培养基，红曲霉选用麦芽汁琼脂培养基，其他菌种选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基。 F.4.2 产毒培养物制备及产毒培养 将送检菌种按照 F.4.1要求转种活化后，加5mL无菌蒸馏水于斜面培养基试管中，用接种针刮取斜面培养基上的菌丝体和孢子制备孢子悬液，取一定量孢子悬液，分别接种于从 F.3.2中选取的所有产毒培养基中，充分混匀后，置28 ℃±1 ℃培养21d(每天将固体/液体培养物振摇、混匀)后，进行真菌毒素测定。可根据不同菌、不同毒素适宜的产毒条件对试验过程中的温度、湿度、光照、通气量、培养时间等进行调整。 F.4.3 真菌毒素测定 按照食品安全国家标准规定的相关检测方法或其他等效方法进行真菌毒素的测定。 |
