E.4
操作步骤
E.4.1
待测菌种的复苏及活化
E.4.1.1 冻干的菌种可按表 E.1给定的培养基，在不含琼脂的相应液体培养基中复苏后再进行测定。
E.4.1.2 将待测菌种按表 E.1的规定，在相应推荐的琼脂培养基和培养条件下活化。若菌种在推荐的
培养基和培养条件下生长状况不佳，则可添加其他适于该菌生长的碳源或改变培养条件，确保菌种生长良好。
表 E.1 推荐的培养条件
|
菌种名称
|
培养基
|
培养温度℃
|
培养条件
|
培养时间h
|
|
双歧杆菌属
|
MRS-半胱氨酸琼脂
|
36±1
|
厌氧
|
24~48
|
|
短乳杆菌
|
MRS琼脂
|
28±1
|
厌氧或兼性厌氧
|
16~24
|
|
植物乳植杆菌/
戊糖乳杆菌
|
MRS琼脂
|
28±1
|
厌氧或兼性厌氧
|
16~24
|
|
清酒广布乳杆菌
|
MRS琼脂
|
28±1
|
厌氧或兼性厌氧
|
16~24
|
|
德氏乳杆菌
|
MRS琼脂
|
36±1
|
厌氧或兼性厌氧
|
16~24
|
|
其他与乳杆菌属培养条件相似的细菌
|
MRS琼脂
|
36±1
|
厌氧或兼性厌氧
|
16~24
|
|
乳酸乳球菌
|
M17-乳糖琼脂或Elliker琼脂
|
32±1
|
厌氧或兼性厌氧
|
16~24
|
|
唾液链球菌嗜热亚种
|
M17-乳糖琼脂或Elliker琼脂
|
36±1
|
厌氧或兼性厌氧
|
16~24
|
|
屎肠球菌
|
MRS琼脂
|
36±1
|
需氧
|
24~48
|
|
注1:短乳杆菌、植物乳植杆菌推荐的培养温度为28℃。由于同种内的不同株间对温度的要求会有差异,因此对这2个种内某些株的培养温度可视情况适当调整。
注2:其他细菌可根据细菌本身特点选择适宜培养基、培养条件和培养时间。
|
E.4.2
质控菌株
每次耐药性测定均需用标准菌株同步操作进行质量控制。
E.4.2.1 推荐使用的质控菌株包括植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)ATCC14917、副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus
paracasei)ATCC334、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)ATCC19435、唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus salivarius subspt.hermophilus)LMG18311、长双歧杆菌长亚种 (Bifidobacterium longum subsp.longum)ATCC15707、粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)ATCC29212。或其他等效菌株。
E.4.2.2 质控菌株的使用条件如下：
a) 待测乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属在28℃±1℃条件下培养时，推荐用植物乳植杆菌 ATCC14917或等效菌株作质控菌株。
b) 待测乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属在32℃±1℃条件下培养时，推荐用乳酸乳球菌乳亚种 ATCC19435或等效菌株作质控菌株。
c) 待测乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属在36℃±1 ℃条件下培养时，推荐用副干酪乳酪杆菌 ATCC334或等效菌株作质控菌株。
d) 对唾液链球菌嗜热亚种进行耐药性测定时，推荐用唾液链球菌嗜热亚种LMG18311或等效菌株作质控菌株。
e) 对双歧杆菌进行耐药性测定时，推荐用长双歧杆菌长亚种 ATCC15707或等效菌株作质控菌株。
f) 对肠球菌进行耐药性测定时，推荐用粪肠球菌 ATCC29212或等效菌株作质控菌株。
E.4.3
微量稀释板的制备
E.4.3.1 抗菌药物种类及配制
试验用抗菌药物种类、浓度范围和配制方法见表 E.2。
表 E.2 试验用抗菌药物及配制a
|
抗菌药物
|
所属类别
|
浓度范围 μg/mL
|
溶剂b
|
稀释剂c
|
|
庆大霉素
|
氨基糖苷类
|
0.5~256
|
水
|
水
|
|
卡那霉素
|
氨基糖苷类
|
2~1024
|
水
|
水
|
|
链霉素
|
氨基糖苷类
|
0.5~256
|
水
|
水
|
|
四环素
|
四环素类
|
0.125~64
|
水
|
水
|
|
红霉素
|
大环内酯类
|
0.016~8
|
95%乙醇或冰乙酸d
|
水
|
|
克林霉素
|
林可酰胺类
|
0.032~16
|
水
|
水
|
|
氯霉素
|
氯霉素类
|
0.125~64
|
95%乙醇
|
水
|
|
氨苄西林
|
青霉素类
|
0.032~16
|
0.1mol/L的磷酸盐缓冲液,pH=8.0
|
0.1mol/L的磷酸盐缓冲液,pH=8.0
|
|
万古霉素
|
糖肽类
|
0.25~128
|
水
|
水
|
|
环丙沙星
|
喹诺酮类
|
0.25~128
|
水
|
水
|
|
泰利菌素
|
大环内酯类
|
0.5~256
|
冰乙酸d
|
水
|
|
黏菌素
|
脂肽类
|
0.25~128
|
水
|
水
|
|
磷霉素
|
磷霉素类
|
1~512
|
水
|
水
|
|
a
表中涉及的溶剂和稀释剂可根据相关资料进行适当调整。
b
用于溶解粉末状抗菌药物的溶液。
c
用于稀释抗菌药物溶液的试剂。
d
使用冰乙酸做溶剂时,先加1/2体积的水做溶剂,然后逐滴加冰乙酸直至药物溶解,并用水补充至所需体积。
|
E.4.3.2 微量稀释板中抗菌药物布局
微量稀释板中抗菌药物布局见表 E.3。
表 E.3 微量稀释板中抗菌药物布局
A板
单位为微克每毫升(μg/mL)
|
抗菌药物
|
1a
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12b
|
|
庆大霉素
|
P
|
0.5
|
1
|
2
|
4
|
8
|
16
|
32
|
64
|
128
|
256
|
N
|
|
卡那霉素c
|
P
|
2
|
4
|
8
|
16
|
32
|
64
|
128
|
256
|
512
|
1024
|
N
|
|
链霉素
|
P
|
0.5
|
1
|
2
|
4
|
8
|
16
|
32
|
64
|
128
|
256
|
N
|
|
四环素
|
P
|
0.125
|
0.25
|
0.5
|
1
|
2
|
4
|
8
|
16
|
32
|
64
|
N
|
|
红霉素
|
P
|
0.016
|
0.032
|
0.064
|
0.125
|
0.25
|
0.5
|
1
|
2
|
4
|
8
|
N
|
|
克林霉素
|
P
|
0.032
|
0.064
|
0.125
|
0.25
|
0.5
|
1
|
2
|
4
|
8
|
16
|
N
|
|
氯霉素
|
P
|
0.125
|
0.25
|
0.5
|
1
|
2
|
4
|
8
|
16
|
32
|
64
|
N
|
|
氨苄西林
|
P
|
0.032
|
0.064
|
0.125
|
0.25
|
0.5
|
1
|
2
|
4
|
8
|
16
|
N
|
|
a P代表阳性对照孔,不添加任何抗菌药物,只添加待测菌悬液和含有用于溶解抗菌药物溶剂(最高浓度)的培养基。
b N 代表阴性对照孔,既不加抗菌药物也不加待测菌株,只添加培养基。
c 对屎肠球菌而言,所使用的卡那霉素质量浓度范围为4μg/mL~2048μg/mL。
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表 E.3 微量稀释板中抗菌药物布局 (续)
B板
单位为微克每毫升(μg/mL)
|
抗菌药物
|
1a
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12b
|
|
万古霉素
|
P
|
0.25
|
0.5
|
1
|
2
|
4
|
8
|
16
|
32
|
64
|
128
|
N
|
|
环丙沙星
|
P
|
0.25
|
0.5
|
1
|
2
|
4
|
8
|
16
|
32
|
64
|
128
|
N
|
|
泰利霉素
|
P
|
0.5
|
1
|
2
|
4
|
8
|
16
|
32
|
64
|
128
|
256
|
N
|
|
黏菌素
|
P
|
0.25
|
0.5
|
1
|
2
|
4
|
8
|
16
|
32
|
64
|
128
|
N
|
|
磷霉素
|
P
|
1
|
2
|
4
|
8
|
16
|
32
|
64
|
128
|
256
|
512
|
N
|
|
a P代表阳性对照孔,不添加任何抗菌药物,只添加待测菌悬液和含有用于溶解抗菌药物溶剂(最高浓度)的培养基。
b N 代表阴性对照孔,既不加抗菌药物也不加待测菌种,只添加培养基。
c 对屎肠球菌而言,所使用的卡那霉素质量浓度范围为4μg/mL~2048μg/mL。
|
E.4.3.3 抗菌药物储备液的制备
所配制抗菌药物储备液的浓度可根据其溶解性而定，但质量浓度至少应在1024μg/mL以上。储备液应按表 E.2要求选用适宜的溶剂，稀释制备成适宜浓度的工作液。如需对储备液进行灭菌处理，可使用无菌滤膜过滤除菌，同时在过滤前后进行比对试验，以确保不出现滤膜吸附抗菌药物而降低药效的现象。所有的抗菌药物储备液均应现用现配，特殊情况(如需要特殊储存条件以确保储备液的稳定性)除外。
| 
