附录 A 食品用细菌致病性试验方法
A.1 范围 本方法规定了食品用细菌的致病性试验方法。 本方法适用于食品用细菌的致病性评价。
A.2 设备和材料 除微生物实验室常规设备外，其他设备与材料如下。 A.2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 A.2.2 离心机：离心力≥3000g。 A.2.3 电子天平：感量分别为0.1g和0.001g。 A.2.4 比浊仪。 A.2.5 温湿度计。温度计允许误差：±1 ℃，湿度计允许误差：±3% RH。 A.2.6 显微镜：10×~100×。 A.2.7 厌氧培养装置：厌氧罐(袋、盒等)或厌氧培养箱。 A.2.8 无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。 A.2.9 无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。 A.2.10 无菌试管：16mm×160mm。 A.2.11 无菌培养皿：直径90mm。 A.2.12 无菌量筒：容量100mL。 A.2.13 微量移液器及配套吸头：量程为100μL~1000μL 。 A.2.14 注射器：量程为100μL~1000μL 。 A.2.15 小鼠灌胃针头。 A.2.16 无菌微孔滤膜：孔径0.22μm。
A.3 培养基和试剂 A.3.1 无菌生理盐水：0.85%的商品化生理盐水或8.5gNaCl溶于1000mL蒸馏水中，分装后121 ℃高压灭菌15min，备用。 A.3.2 LB(Luria-Bertan，LB)肉汤培养基：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121 ℃高压灭菌15min，备用。 A.3.3 LB琼脂平板：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121 ℃高压灭菌15min，制备 LB琼脂平板，备用。 A.3.4 半胱氨酸盐酸盐储备液：称取500mg半胱氨酸盐酸盐于50mL无菌离心管中，加入10mL蒸馏水，充分溶解后用0.22μm 无菌微孔滤膜过滤除菌，备用。 A.3.5 含有半胱氨酸盐酸盐的 MRS(ManRogosaSharpe)肉汤培养基：商品化 MRS肉汤培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121 ℃高压灭菌15min，待培养基冷却至50 ℃左右时，加入A.3.4中制备的半胱氨酸盐酸盐储备液，使培养基中半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500μg/mL，备用。 A.3.6 含有半胱氨酸盐酸盐的 MRS琼脂平板：商品化的 MRS琼脂培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121 ℃高压灭菌15min，待培养基冷却至50 ℃左右时，加入 A.3.4中制备的半胱氨酸盐酸盐储备液，使培养基中半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500μg/mL，制备含有半胱氨酸盐酸盐的 MRS琼脂平板，备用。 A.3.7 含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板：商品化的双歧杆菌琼脂培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121 ℃高压灭菌15min，待培养基冷却至50 ℃左右时，加入 A.3.4中制备的半胱氨酸盐酸盐储备液，使半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500μg/mL，制备含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板，备用。
A.4 实验动物 选用SPF级昆明或ICR健康成年小鼠，雌雄各半，体重范围为18.0g~22.0g。动物质量、实验室管理、试验条件等符合 GB/T35823《实验动物 动物实验通用要求》的规定。
A.5 操作步骤 对于国内外均无使用历史的菌种，或国内外虽有使用历史，但对人和动物健康有不良影响记载或报道的菌种，必须使用腹腔注射和经口灌胃2种途径给予动物受试物，以评价受试物不同给予途径对动物的致病性。 对于国内外有使用历史且使用过程中未发现对人和动物健康有不良影响的菌种，可选择经口灌胃单一途径给予动物受试物，以评价受试物对动物的致病性。
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