附录 D 食品用放线菌的致病性试验方法
D.1 范围 本方法规定了食品用放线菌的致病性试验方法。 本方法适用于食品用放线菌的致病性评价。
D.2 设备和材料 除微生物实验室常规设备外，其他设备与材料如下。 D.2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 D.2.2 离心机：离心力≥3000g。 D.2.3 电子天平：感量分别为0.1g和0.001g。 D.2.4 比浊仪。 D.2.5 温湿度计。温度计允许误差：±1 ℃，湿度计允许误差：±3% RH。 D.2.6 显微镜：10×~100×。 D.2.7 无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。 D.2.8 无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。 D.2.9 无菌试管：16mm×160mm。 D.2.10 无菌培养皿：直径90mm。 D.2.11 无菌量筒：容量100mL。 D.2.12 微量移液器及配套吸头：量程100μL~1000μL。 D.2.13 注射器：量程100μL~1000μL。 D.2.14 小鼠灌胃针头。
D.3 培养基和试剂 D.3.1 葡萄糖天门冬素培养基：葡萄糖10g、天门冬素0.5g、K2HPO40.5g，加水至1000mL，调节 pH 至7.2~7.4，分装后121 ℃高压灭菌15min，备用。商品化葡萄糖天门冬素琼脂培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121 ℃高压灭菌15min，制备葡萄糖天门冬素平板，备用。 D.3.2 高氏1号培养基：可溶性淀粉20g、KNO31.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、琼脂粉15.0g，加蒸馏水1000mL，调节pH 至7.2~7.4，分装后121 ℃高压灭菌20min，备用。商品化高氏1号琼脂培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121 ℃高压灭菌20min，制备高氏1号平板，备用。 如菌种在葡萄糖天门冬素培养基或高氏1号培养基上的生长状态不理想，可选用适于该菌种生长的其他培养基。
D.4 实验动物 见 A.4。
D.5 操作步骤 对于国内外均无使用历史的菌种，或国内外虽有使用历史，但对人和动物健康有不良影响记载或报道的菌种，必须使用腹腔注射和经口灌胃2种途径给予动物受试物，以评价受试物不同给予途径对动物的致病性。 对于国内外有使用历史且使用过程中未发现对人和动物健康有不良影响的菌种，可选择经口灌胃单一途径给予动物受试物，以评价受试物对动物的致病性。 D.5.1 腹腔注射 D.5.1.1 菌种活化：将放线菌菌种接种于葡萄糖天门冬素培养基或改良高氏1号培养基或适于该菌种生长的其他培养基平板，并在适宜的培养条件下(包括培养温度、湿度、通气量等)培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异)，确认为纯培养后备用。 D.5.1.2 菌悬液制备：刮取 D.5.1.1平板上的菌落，将其悬浮于无菌生理盐水中，充分混匀后，用适量无菌生理盐水调整菌悬液浓度，使最终菌悬液中的菌浓度约为5.0×107 CFU/mL，用于小鼠腹腔注射。 D.5.1.3 腹腔注射：小鼠不少于40只，雌雄各半，随机分成4组(每组不少于10只)，包括雄性小鼠无菌生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠无菌生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组。注射量为0.2mL/只，即受试物组每只小鼠注射菌量至少1×107 CFU。 D.5.1.4 动物观察：动物腹腔注射后每天观察1次，连续观察至少21d。观察指标同 A.5.1.4。 D.5.2 经口灌胃 D.5.2.1 菌数预估 同 A.5.2.1。 D.5.2.2 菌悬液制备 D.5.2.2.1 培养上清液的制备：同 A.5.2.2.1。 D.5.2.2.2 菌悬液原液的制备：同 A.5.2.2.2。 D.5.2.2.3 5倍浓缩菌悬液的制备：同 A.5.2.2.3。 D.5.2.3 灌胃 同 A.5.2.3。 D.5.2.4 观察 同 A.5.2.4。
D.6 结果与报告 对 D.5.1和 D.5.2的动物试验结果进行统计学分析和综合评价，内容同 A.6。 |
