关于发布《感染性腹泻诊断标准》等4项法定传染病诊断标准的通告

B.6.1.3 标本保存与运输

通常对于短途运输（1 d以内），包装盒内放冰袋或冰排，长途运输（1 d～2 d）要用干冰。标本在4 ℃短期储存，不能超过3 d。标本如果近期不进行检测，应直接在-20 ℃或-80 ℃下长期贮存，并避免反复冻融。

B.6.2 实验室检查

B.6.2.1 透射电镜检查

B.6.2.1.1 腹泻病例粪便上清液0.2 mL～0.5 mL。

B.6.2.1.2 直径约为3 mm的覆盖有机膜和碳膜的200目～400目铜网。

B.6.2.1.3 染色液：1%磷钨酸（pH6.8）。

B.6.2.1.4 血清

为提高电镜的检出率，免疫负染电镜检测前准备病例恢复期血清或轮状病毒免疫动物血清：

a) 病例恢复期血清(1:5或1:10稀释)；

b) 轮状病毒动物免疫血清，其效价1:64以上，用时以生理盐水做1:20～1:50稀释。

B.6.2.1.5 直接负染法

取腹泻病例粪便标本约0.2mL～0.5mL，以3000r/min离心15 min～20min，取上清 5μL～10 μL滴加到自锁镊子加持的覆膜面向上放置的铜网上，至少1min后用滤纸在铜网边缘吸除标本液滴。再将5μL～10μL染液滴加在铜网上，染色1 min，用滤纸在铜网边缘吸除染液，室温干燥后进行透射电镜观察、检测。视野内看到轮状病毒颗粒即可确定。

B.6.2.1.6 免疫负染法

取经3000 r/min离心的粪便上清液50 μL～100 μL，加入病例恢复期血清或轮状病毒动物免疫血清(稀释后)50 μL～100μL混合，37 ℃作用1 h，4℃过夜。取上述混合液5 μL～10 μL滴加到自锁镊子加持的覆膜面向上放置的铜网上，至少1min后用滤纸在铜网边缘吸除标本液滴。再将5 μL～10 μL染液滴加在铜网上，染色1min，用滤纸在铜网边缘吸除染液，室温干燥后进行透射电镜观察、检测。视野内看到轮状病毒颗粒即可确定。

B.6.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

将粪便标本用PBS稀释成10%，加SDS（终浓度为1%）于56 ℃处理30 min后，使用商品化试剂盒提取病毒RNA，用10%不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳后用硝酸银染色，可见清晰、典型的11条dsRNA条带，根据电泳图型判定结果。

a）A组轮状病毒是婴幼儿腹泻的主要病原，电泳图可见11条RNA分4组区带，其分布模式为4：2：3：2。第Ⅳ组含RNA第10和第11节段，根据其电泳迁移距离不同，把A组轮状病毒进一步分为两个亚群：亚群I为短型（S型），两片段距离短；亚群Ⅱ为长型（L型），两片段距离长。

b）B组轮状病毒即成人腹泻轮状病毒，主要引起青壮年腹泻。11条RNA电泳图的分布模式为4：2：1：1：1：1：1（或4：2：2：3），RNA第7、8、9节段明显分开。

c）C组轮状病毒，主要引起婴幼儿腹泻，11条RNA电泳图的分布模式为4：3：2：2，易于与A组和B组轮状病毒区别。

d）H组轮状病毒即新型成人腹泻轮状病毒。11条RNA电泳图的分布模式为4：2：1：1：1：1：1，RNA第3、4节段分开，第5、6节段靠近，第7、8、9节段明显分开。

B.6.2.3 琼脂糖凝胶电泳

提取的病毒RNA直接用1%琼脂糖凝胶电泳1 h～1.5 h，，依据电泳图型判定结果。此法比PAGE电泳分析简单快速，但检测灵敏度较低。

B.6.2.4 免疫学检测

B.6.2.4.1 胶体金免疫层析试验

检测粪便中A组轮状病毒抗原，有商品试剂盒供应，试验按常规方法进行。

B.6.2.4.2 ELISA方法

检测粪便中A组轮状病毒抗原，有商品试剂盒供应，试验按常规方法进行。

B.6.2.4.3 抗体检测

恢复期血清与A组轮状病毒抗原结合较急性期血清4倍及以上增加。不用于常规检测。

B.6.2.5 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

根据病毒VP7或VP4基因在不同型的轮状病毒株间有高度变异而在同型毒株之间这一变异区高度保守的特征，运用逆转录后巢式PCR可区分轮状病毒的不同基因型，并可检测到不同轮状病毒的混合感染。根据检测不同基因片段的需要有多种引物序列可选择，见表B.14。PCR反应体系及反应条件按选择的试剂及扩增仪而有所不同。扩增产物按常规进行电泳及结果判断。

B.6.2.6 病毒分离

B.6.2.6.1 细胞系

原代非洲绿猴肾或传代非洲绿猴肾细胞（MA104）等。

B.6.2.6.2 细胞培养基成分

DMEM培养液、青/链霉素（10000 U/mL、10000 μg/mL）、胎牛血清、15 μg/mL胰蛋白酶。

B.6.2.6.3 生长液

100 mLDMEM生长液中包含DMEM培养液89 mL、胎牛血清10 mL、青/链霉素1 mL。

B.6.2.6.4 维持液

DMEM培养液（含2 μg/mL～10 μg/mL胰蛋白酶）。

B.6.2.6.5 试验步骤

取粪便上清液0.2 mL～0.5 mL先加青/链霉素0.2 mL，4 ℃过夜处理或用0.4 5μm滤器过滤除菌，将标本用终浓度为15 μg/mL胰蛋白酶在37℃作用1 h，接种到生长至80%单层细胞培养管，37 ℃吸附1h，弃去标本液，换上细胞维持液（含2 μg/mL～10 μg/mL胰蛋白酶），在37 ℃孵育至出现细胞病变，按照上述方法在细胞内连续传代3次。对于粪便标本中轮状病毒的初次分离，宜先在原代细胞上传几代适应后再传至MA104细胞大量增殖。一般实验室限于条件，不宜做到病毒分离。