关于发布《感染性腹泻诊断标准》等4项法定传染病诊断标准的通告

*该引物覆盖除stx2f亚型外的其他stx2亚型。

B.2.4 血清分型

在通过特异性基因检测确定大肠埃希菌的致病型后，可进行O抗原和H抗原分型分析。O:H血清型可通过传统血清凝集法确定，亦可通过针对特异性O抗原基因簇和H抗原基因的PCR方法进行确定。

B.3 致泻性弧菌检验

B.3.1 标本的收集

急性期、未用抗生素前采集病例新鲜粪便标本或（和）呕吐物标本2 g～5 g或2 mL～5 mL，所采集标本尽快检测。运送时间超过2h者，标本应放入Cary-Blair运送培养基中；或将粪便标本直接接种增菌培养基，室温条件下运送。

B.3.2 分离培养

B.3.2.1 直接分离培养

取新鲜粪便接种于硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）琼脂或（和）弧菌显色琼脂等选择性培养基，35℃～37℃培养18h～24h，从平板上挑取可疑菌落做进一步鉴定。霍乱弧菌、副溶血性弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌在选择性培养基上生长特性见表B.7。

B.3.2.2 增菌培养

取新鲜粪便0.5 g～1 g或0.5 mL～ 1mL接种于pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水增菌液，35 ℃～37 ℃培养6h～8h，从菌膜下表层取一接种环培养物，划线接种于TCBS或（和）弧菌显色琼脂平板，35 ℃～37 ℃培养18 h～24 h进行分离培养，挑取可疑菌落（见表B.7）做进一步鉴定。

表 B.7 致泻性弧菌在选择性琼脂平板上的菌落特征

B.3.3 鉴定

B.3.3.1 镜检

致泻性弧菌革兰染色显微镜下可见革兰阴性无芽孢杆菌，细菌形态呈杆状、弧状等，常呈多形性。新鲜培养物悬滴法直接镜检在暗室野下可见穿梭状快速运动。

B.3.3.2 生化试验

挑取可疑菌落进行生化初筛（KIA/MIU）、氧化酶、黏丝试验，致泻性弧菌氧化酶阳性，黏丝试验阳性（副溶血弧菌除外）；或用生化仪或生化条进行鉴定。致泻性弧菌不同种的具体生化特征见表B.8。

a)氧化酶试验：用铂/铱接种环或牙签从无碳水化合物成分的非选择性琼脂上挑取可疑菌落的新鲜培养物，涂抹在滤纸上，取2滴～3滴氧化酶试剂（1%盐酸四甲基对苯二胺）滴加在菌苔上，20s内出现深紫色、紫罗兰或深蓝色为阳性。

b)黏丝试验：在玻片或平皿上滴一大滴0.5%去氧胆酸钠水溶液，从普通琼脂或其他非选择性琼脂上取一接种环可疑菌落18 h～24 h培养物，放在溶液旁研磨混匀，再与溶液混合制成浓厚悬液。在1min内菌悬液由混变清并变得很黏稠，用接种环挑取可拉出细丝来者为阳性。阴性者呈均匀悬液状态，与蒸馏水对照相同。

B.3.3.3 血清凝集试验

目前致泻性弧菌中只有霍乱弧菌和副溶血弧菌具有商品化的诊断血清，生化符合的副溶血弧菌和霍乱弧菌可用相应诊断血清做玻片凝集试验进一步鉴定，同时用生理盐水做对照。注意TCBS培养基上的疑似菌落常难以乳化，不宜直接进行玻片凝集，应挑取可疑菌落，先接适宜盐浓度的普通琼脂培养基纯培养后再做玻片凝集。

副溶血弧菌血清凝集试验先准备较浓厚菌悬液，K抗原检测先用不同K混合多价血清与制备的菌悬液做玻片凝集，阳性者再用相应的组份单因子K抗血清进行凝集检测。O抗原检测先将菌悬液121 ℃灭菌处理1h，菌体沉淀离心重悬再与O群血清做玻片凝集。

霍乱弧菌直接从普通琼脂培养基上挑取菌落与O1和O139群特异性霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集，很快出现肉眼可见凝集颗粒者确定为阳性。与O1群血清凝集者，可进一步用小川和稻叶型诊断血清分型。不与O1和O139群诊断血清发生凝集，但生化符合的霍乱弧菌可归为非O1非O139群霍乱弧菌。

B.3.3.4 分子鉴定

可用经过评价的特异性和敏感性较高的种特异性的引物对可疑菌株进行PCR分子鉴定，使用商业化试剂盒提取菌株DNA或制备菌落水煮模板。注意PCR检测每次试验均设阴、阳性对照及空白对照，推荐的参考引物见表B.9。也可使用市售的检测规定片段的商品化试剂盒进行鉴定。

B.3.4 菌型的判定和结果报告

综合生化试验、血清学分型鉴定和分子生物学检测结果，判定感染菌型并报告结果。