B.4 弯曲菌检验 B.4.1 标本收集 于急性期、未用抗生素前采集病例新鲜粪便标本5 g～10 g，立即送实验室进行培养，运送时间超过2h者，应放入Cary-Blair运送培养基，4 ℃冷藏送检；粪便量较少（黄豆粒大小）、便拭子或肛拭子，可直接将标本保存到Cary-Blair运送培养基或者弯曲菌增菌液中，4 ℃冷藏保存，当天运送实验室检测。保存在增菌液中的标本，运送至实验室后，应至少在24h内，按照增菌培养条件进行增菌培养。 B.4.2 标本的分离培养检测 B.4.2.1 培养条件 本菌为微需氧菌，在5%O2、10%CO2、85%N2条件下生长最好。可使用混合气体法或能产生同样气体环境的其他产气装置。空肠弯曲菌和结肠弯曲菌最适宜的培养温度为42 ℃。增菌培养可在微需氧环境下42 ℃增菌24 h～36 h。在平皿上的培养需要在同样微需氧环境下42 ℃培养24 h～48 h。 B.4.2.2 直接划线培养 采集的病例新鲜粪便标本可直接划线接种于Skirrow 血琼脂平板与Karmali选择性琼脂平板，42 ℃微需氧倒置培养2 4h～48 h。培养24 h后如有疑似菌落，则进行B.1.3鉴定，培养24 h后如细菌生长缓慢或者菌落很小，可增加培养时间至48 h，72 h后仍无疑似菌落判断为阴性。 B.4.2.3 增菌过滤培养 从便盒中，挑取黄豆粒大小人粪标本（或取300 μL～500 μL水样便），加入2 mL的弯曲菌Preston增菌液中，充分混匀。将便拭子或者肛拭子放入2 mL的Preston的弯曲菌增菌液中，充分挤压混匀，取出棉签。将加入标本的增菌液在微需氧环境下，42 ℃增菌培养24 h。 使用0.45 μm滤膜，将其轻轻贴在哥伦比亚血琼脂平板和Karmali琼脂平板中央表面，取出增菌培养物，拧紧培养管的管口后轻轻混匀，拧开关口，取300 μL～500 μL的增菌培养物，分成4点～6点，呈梅花样滴加于滤膜上，注意滴加的液体不能超过滤膜的边缘。在生物安全柜中，等待滤膜上的液体充分透过滤膜（约45min～60min），迅速揭掉滤膜，翻转培养平板，置于微需氧环境中42 ℃或者37 ℃，培养24 h～48 h。培养24 h后如有疑似菌落，则进行菌落鉴定，培养24 h后如细菌生长缓慢或者菌落很小，可增加培养时间至48 h，72h后仍无疑似菌落判断为阴性。 B.4.3 菌落鉴定 B.4.3.1 形态 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的形态特征如下。 a) 疑似菌落：空肠弯曲菌和结肠弯曲菌典型菌落形态一般有两种，一种呈浅灰或灰白色、半透明而中心颜色较暗，圆形，光滑，中间凸起、针尖状或小水珠状，直径 1 mm～3 mm，边缘整齐、有光泽的单个菌落；另一种呈浅灰白色、半透明、扁平或稍突起、水滴状，形状常呈不规则圆盘状，直径2 mm～5 mm的单个菌落，培养时间增加，菌落直径变大。 b) 革兰染色：空、结肠弯曲菌为革兰阴性，菌体弯曲如小的半个括号状，或呈S形、螺旋状或海鸥展翅状。 B.4.3.2 生化试验鉴定 B.4.3.2.1 氧化酶试验 挑取至少5个疑似菌落接种到哥伦比亚血琼脂平板进行分纯培养，用接种环或玻璃棒挑取菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在10s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性。空肠弯曲菌氧化酶试验阳性，结肠弯曲菌氧化酶试验阳性。 B.4.3.2.2 马尿酸盐水解试验 挑取至少5个疑似菌落接种到哥伦比亚血琼脂平板进行分纯培养,用接种环刮取菌苔，接种到0.4 mL含1％的马尿酸钠溶液中，振摇试管以分散培养物，置37 ℃培养2 h。然后向试管中加入0.2 mL茚三酮试剂，将试管于37 ℃放置10min，出现紫、蓝色者为阳性反应，无色或灰色为阴性反应。以阴性菌和阳性菌做对照。空肠弯曲菌马尿酸盐水解试验阳性，结肠弯曲菌马尿酸盐水解试验阴性。 B.4.3.2.3 吲哚乙酸酯水解试验 取50μL含10％吲哚乙酸酯的溶液，将其吸附到直径为6 mm的纸片上，将纸片在空气中晾干。挑取至少5个疑似菌落接种到哥伦比亚血琼脂平板进行分纯培养,挑取分纯后的可疑菌落生长物，将其直接涂布在纸片上，同时滴加一滴无菌蒸馏水，观察5min～10min。纸片显示蓝绿色为弯曲菌反应阳性。空肠弯曲菌吲哚乙酸酯水解试验阳性，结肠弯曲菌吲哚乙酸酯水解试验阳性。 B.4.3.2.4 过氧化氢酶试验 挑取至少5个疑似菌落接种到哥伦比亚血琼脂平板进行分纯培养, 用接种环挑取菌落，加到干净玻片上的3%过氧化氢溶液中，如果在30s内出现气泡则判定结果为阳性。空肠弯曲菌过氧化氢酶试验阳性，结肠弯曲菌过氧化氢酶试验阳性。 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的生化鉴定特征见表B.10。 表 B.10 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌生化试验结果
B.4.3.3 核酸检测鉴定 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌多重 PCR 鉴定的引物序列及扩增片段长度见表 B.11。 | ||||||||||||||||||
鄂公网安备42011102005941号