关于发布《感染性腹泻诊断标准》等4项法定传染病诊断标准的通告

附 录 B

（规范性）

实验室诊断方法

B.1 沙门菌检验

B.1.1 标本收集

采集腹泻病例急性期、宜在抗生素应用以前的新鲜粪便2 g～5 g或2 mL～5 mL，置于干净广口容器内，粪便挑取有脓血、黏液部分，尽快检验。运送时间超过2h者，标本应放入Cary-Blair运送培养基中，在4 ℃冷藏条件下48 h内送检，超过48h未送检的粪便，宜在-80℃30%甘油肉汤冻存；或将粪便标本直接接种增菌培养基，室温条件下运送。如不易获得粪便，或排便困难的病例及幼儿，可采用直肠拭子法采便：将棉拭子前端用30%无菌甘油或等渗盐水（0.9%氯化钠）浸润（棉拭子多余的液体贴管壁挤出），然后插入肛门4 cm～5 cm（幼儿约2 cm～ 3cm）处，轻轻在直肠内旋转，于紧靠肛环边的隐窝处采集直肠表面黏液后取出，拭子放入可旋盖密封的离心管或含Cary-Blair培养基的离心管中，旋紧盖子以防水分丢失和漏洒。肛拭子运送条件同新鲜粪便。

B.1.2 分离培养

B.1.2.1 直接分离培养

腹泻粪便中沙门菌直接分离培养阳性率低于增菌培养，常规不推荐粪便直接分离培养沙门菌。

取新鲜粪便、呕吐物标本直接接种于中等强度选择性培养基[沙门菌显色培养基、木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂（XLD）、亚硫酸铋琼脂（BS）、Hektoen肠道菌（HE）琼脂等]和弱选择性培养基（麦康凯琼脂（MAC）、伊红美蓝琼脂（EMB））平板各一块，35℃～37℃培养18 h～24 h，从平板上挑取可疑菌落（见表B.1）进行鉴定。

表 B.1 沙门菌属在选择性琼脂平板上的菌落特征

B.1.2.2 增菌培养

取新鲜粪便、呕吐物0.5 g～1 g或1mL接种于10 mL亚硒酸盐煌绿增菌液（SBG）或四硫酸钠煌绿增菌液（TTB）或亚硒酸盐半胱氨酸增菌液（SC）中；35 ℃～37 ℃增菌6 h～8 h，挑取1～2接种环增菌液分别转种至强选择性和弱选择性培养基平板各一块，35 ℃～37 ℃培养18 h～24 h，从平板上挑取可疑菌落（见表B.1）进行鉴定。

将肛拭子直接置于10mL亚硒酸盐煌绿增菌液（SBG）或亚硒酸盐半胱氨酸增菌液（SC）中；35 ℃～37 ℃增菌6 h～ 8h，挑取1～2接种环增菌液分别转种至强选择性和弱选择性培养基平板各一块，35 ℃～37 ℃培养18 h～24 h，从平板上挑取可疑菌落（见表B.1）进行鉴定。

B.1.3 鉴定

B.1.3.1 镜检

沙门菌革兰染色显微镜下可见革兰阴性小杆菌，大小（1～3） μm×（0.4～0.9） μm。

B.1.3.2 生化试验

挑取可疑菌落接种于三糖铁（TSI）或双糖铁（KIA）和动力吲哚尿素（MIU）培养基上，并做氧化酶、硝酸盐还原、氰化钾（KCN）抑菌、赖氨酸脱羧试验；或接种于细菌生化鉴定板（条）；或利用微生物自动鉴定系统（仪）进行鉴定。凡生化反应符合表B.2、表B.3的菌株，随后利用沙门菌属诊断血清做玻片凝集试验。

表 B.2 沙门菌在 TSI 或 KIA 琼脂内的反应结果

表 B.3 沙门菌生化反应结果

B.1.3.3 血清凝集试验

O抗原试验：用A～F或A～S多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。对A～F多价O血清凝集者，依次用O4；O7；O8；O9；O2和O11等因子血清做凝集试验。生化符合沙门氏菌属定义，但A～F或A-S“O”多价血清不凝集，送具备菌株分型和鉴定资质的实验室进一步鉴定。

H抗原试验：先用多价H血清做凝集试验，如有一种或两种多价血清凝集，再用这种多价血清的各种H单因子血清检查以确定第1相和第2相的H抗原，必要时做反相诱导。

Vi抗原试验：用Vi因子血清检测。

B.1.3.4 分子鉴定

利用经过评价的特异性及敏感性均较高的引物对疑似沙门菌菌落进行1个或多个沙门菌特异靶基因或核酸片段的扩增，从而快速鉴定沙门菌属或其血清型。

B.1.4 菌型的判定和结果报告

综合以上生化试验和血清学分型鉴定结果，判定血清型并报告结果，注意报告血清型名称的同时报送抗原式，无法确定具体血清型时则报告抗原式，对于邦戈尔沙门菌及肠道沙门菌亚种II、IIIa、IIIb、IV、VI则报告亚种名称加抗原式，对于已经进行血清凝集试验但暂时无法获得准确血清型的菌株则报告未分型。结果报告格式示例：

a）检出沙门菌，鼠伤寒血清型（4,5,12:i:1,2）；

b）检出沙门菌，鼠伤寒变种（4,5,12:i:-）；

c）检出沙门菌，4,5,12:-:-；

d）检出沙门菌，4,5,12:-:1,2；

e）检出沙门菌，肠道亚种II（58:l,z13,z28:z6）；

f）检出沙门菌，肠道亚种IIIa（13,23,:g,z51:-）；

g）检出沙门菌，未分型。