B.9.2 病原学鉴定 B.9.2.1 标本制备 粪便直接涂成1.5 cm大小的粪膜（厚度以覆在报纸上时可透过图片看到字为宜），在自然或37 ℃下使之充分干燥后，滴加无水甲醇固定3 min～5 min。 B.9.2.2 金胺-酚染色法 B.9.2.2.1 试剂配制 0.1 %金胺-酚染色液（第一液）：金胺0.1 g，苯酚5 g，蒸馏水定容至100 mL，用蒸馏水溶解苯酚，缓慢加入金胺，用滤纸过滤到棕色试剂瓶中，室温贮藏；3%盐酸酒精（第二液）：盐酸 3mL，95 %酒精100 mL，转移到棕色瓶中，室温贮藏；0.5 %高锰酸钾液（第三液）：高锰酸钾0.5 g，蒸馏水100 mL，将高锰酸钾加到蒸馏水中，充分搅拌，过滤至棕色试剂瓶中，室温贮藏。 B.9.2.2.2 染色步骤 滴加第一液于晾干的粪膜上，10 min～15 min后自来水漂洗；滴加第二液，脱色1 min后水洗；滴加第三液，染色1 min后水洗，晾干后，置于荧光显微镜下观察结果。 注：染色所用的金胺-酚和高锰酸钾溶液配制后，不宜超过1个月，否则影响染色结果。 B.9.2.2.3 结果判定 染色后的标本在荧光镜低倍下卵囊为一圆形亮点，高倍下发出乳白色或略带绿色的荧光，多数卵囊周围深染，中央淡染，似厚环状，或深色结构偏位，有些全为深染。卵囊多时似繁星，即使不再用其他方法染色亦可判断。但有的标本可出现非特异的荧光颗粒，应注意鉴别，特别注意与环孢子虫卵囊的鉴别，环孢子虫卵囊荧光着色偏暗，内含暗色颗粒状物，或呈不规则的筛网状。本法简便、敏感，适用于批量过筛检查。 B.9.2.3 改良抗酸染色法 B.9.2.3.1 试剂配制 石炭酸复红染色液（第一液）：碱性复红4 g，95 %酒精2 0mL，苯酚8 mL，蒸馏水100 mL，将碱性复红溶于95%酒精，搅拌至全部溶解，缓慢加入苯酚至混合均匀，定容至100 mL，滤纸过滤除去碎渣贮存于棕色试剂瓶中，室温贮藏；10 %硫酸溶液（第二液）：纯硫酸10 mL，蒸馏水90 mL（边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中），转移至棕色试剂瓶中，室温贮藏；2 %孔雀绿原液：孔雀绿2 g，蒸馏水100 mL，过滤至棕色试剂瓶中，室温贮藏，1:10孔雀绿工作液（第三液）：孔雀绿原液1 mL，蒸馏水9 mL。 B.9.2.3.2 染色步骤 粪便涂片和固定方法同前。滴加第一液于粪膜上，2 min～10 min后自来水漂洗；滴加第二液，至涂片呈粉红色为止（1min～10min），自来水漂洗；滴加第三液，染色1min～2min后自来水漂洗，晾干，光学显微镜油镜镜检。 B.9.2.3.3 结果判定 粪便涂片经本法染色后，卵囊为玫瑰色，背景为蓝绿色，卵囊圆或椭圆形，直径4μm～6μm，因观察的角度不同，囊内子孢子排列似不规则，呈多形态状，残余体为暗黑（棕）色颗粒状。经该法染色的标本大多存在许多非特异的抗酸红色颗粒（婴儿的粪便中没有或很少），大小不等，染色均匀一致，不发亮，内部无结构。此外，环孢子虫卵囊用该法染色后不发亮，呈淡红或深红，内含大小不等的暗黑色颗粒，分布不均匀，有的卵囊不着色，只见暗色颗粒状物。观察时应注意区别。 B.9.2.4 金胺酚-改良抗酸染色法 B.9.2.4.1 试剂配制 试剂配制同本标准第B.9.2.2.1条和第B.9.2.3.1条。 B.9.2.4.2 染色步骤 先进行金胺-酚染色后，再用改良抗酸染色法复染。 B.9.2.4.3 结果判定 复染后卵囊形态同抗酸染色法所见，但非特异性颗粒被染成了蓝黑色，极易鉴别。 B.9.3 抗原检测 采用基于单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条或者间接荧光抗体试验，检测隐孢子虫的抗原或者在荧光显微镜下检测隐孢子虫卵囊。采集粪便标本，按照商品化试剂盒产品说明书要求操作和判读结果。 B.9.4 核酸检测 常用核酸检测方法如表B.18所示。 表 B.18 隐孢子虫核酸检测引物序列（巢氏 PCR 法）
B.10 蓝氏贾第鞭毛虫检验 B.10.1 标本收集 粪便、小肠液按照常规方法收集，如不能及时进行检测，可放在4 ℃保存, 通常存放不超过7 2h。贾第鞭毛虫在发育过程中有滋养体和包囊两种形态，贾第虫病病例的水样稀便多见滋养体，而糊状或块状粪便可能仅含有包囊。 B.10.2 病原学鉴定 B.10.2.1 滋养体的检查 标本先以500 g离心10min，取沉淀用生理盐水涂片，用光学显微镜检查。形态从正面观呈倒置纵切梨性，前端钝圆，后端尖细，大小为（12～15） μm×（6～8） μm，厚2 μm～ 4μm。侧面观呈瓢状，背面隆起，腹部内陷形成吸盘。在新鲜标本，虫体靠鞭毛摆动很活泼。由于滋养体只存在于新鲜的水样粪便标本中，且分解快，故检测滋养体操作要迅速。 B.10.2.2 包囊的检查 包囊出现在糊状或成形粪便或十二指肠液中，可用碘液（2 %）染色法、乙醚乙醛沉淀法和硫酸锌离心浮聚法检查。包囊的形成呈间歇性，宜隔天检查，连续3 d。包囊呈椭圆形，大小为（8～12）μm×（7～10）μm。囊壁与虫体之间有明显的不均匀空隙，成熟包囊内有4个核。 B.10.2.3 Trichrom染色(三原染色) 三原染色既可用新鲜粪便，也可用PVB固定的粪便。在固定和染色理想的标本中，背景是蓝绿色，虫体的细胞质和染色质呈紫红色。新鲜标本观察到的包囊呈现典型的卵(椭) 圆形，一般长11μm～14μm ，成熟的包囊可看到有4个核，未成熟的包囊有2个核；而滋养体则为梨形。Trichrom染色后看到的滋养体呈典型梨状，有两个泡状核，位于轴柱的两侧，核内各有一个大核仁，四周有空隙，使并列的双核构成独特的梨形，而鞭毛则极少在染色的标本中出现。 B.10.3 抗原检测 国外已有多种免疫学检测贾第虫包囊囊壁抗原的商品试剂盒面世，按诊断原理分为酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒和间接荧光抗体（IFA）试剂盒，主要检测粪便中的贾第虫包囊囊壁抗原。采集粪便标本，按照商品化试剂盒产品说明书要求操作和判读结果。 B.10.4 核酸检测 核酸检测方法目前仍处于试验阶段，无商品化的核酸试剂盒。 |
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