B.7 诺如病毒检验 B.7.1 标本收集 B.7.1.1 诺如病毒检测首选粪便标本。粪便标本在出现症状后2 d～3 d内采集，置于无菌容器内，每份标本量约5 g或5 mL以上。 B.7.1.2 呕吐物每份标本采集5 g或 5 mL以上，置于无菌容器内。 B.7.1.3 肛拭子：肛拭棉签放入无菌带盖装有2mL无菌PBS缓冲液（10 mmol/L，pH 7.0～7.4）中。 B.7.1.4 采集病例急性期（发病5d内）和恢复期（发病3周～6周）血液样本，分离血清后－20℃长期保存。血清标本不建议做常规诊断。 B.7.1.5 标本保存和运输同轮状病毒第B6.1.3条。 B.7.2 实验室检查 B.7.2.1 电镜检查 试验方法同轮状病毒电镜检查。 B.7.2.2 免疫学检测 B.7.2.2.1 ELISA方法 商品化抗原诊断试剂盒可用于诺如病毒的检测，具体操作按其说明书进行。由于ELISA方法敏感性较低，ELISA检测阴性标本仍需核酸检测进一步确认。 B.7.2.2.2 抗体检测 恢复期血清与诺如病毒病毒样颗粒（VLP）结合较急性期血清4倍及以上增加，不用于常规检测。 B.7.2.3 RT-PCR B.7.2.3.1 实时逆转录聚合酶链式反应（Real-time RT-PCR） Real-time PCR是检测诺如病毒金标准。按常规提取病毒RNA，商品化诺如病毒Real-time RT-PCR检测试剂盒可用来检测诺如病毒，方法按试剂盒说明书进行，也可按表B.15引物和探针进行检测。
B.7.2.3.2 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） Real-time RT-PCR检测阳性的核酸，进一步用传统RT-PCR扩增，PCR产物进行测序，通过序列与参考株的系统进化分析，可进行基因分型，扩增区域为部分聚合酶和衣壳区，引物详见表B.16。RT-PCR反应体系及反应条件按选择的试剂及扩增仪有所不同。扩增产物按常规进行电泳及结果判断。 表 B.16 用于诺如病毒基因分型的引物
B.8 肠腺病毒检验 B.8.1 标本收集 同本标准第B.6.1条。 B.8.2 实验室检测 B.8.2.1 免疫学检测 B.8.2.1.1 胶体金免疫层析试验：有商品试剂盒供应，试验按常规方法进行。 B.8.2.1.2 ELISA方法：有商品试剂盒供应，试验按常规方法进行。 B.8.2.1.3 抗体检测：恢复期血清与抗原结合较急性期血清4倍及以上增加。不用于常规检测。 B.8.2.2 聚合酶链反应（ PCR方法） B.8.2.2.1 Real-time PCR检测 商品化腺病毒Real-time PCR检测试剂盒可用来检测腺病毒，方法按试剂盒说明书进行，也可按以下引物和探针进行检测（表B.17）。 表 B.17 用于肠腺病毒检测的引物
B.8.2.2.2 传统PCR检测 采用与Ad40及Ad41六邻体基因高度保守区互补引物扩增腺病毒DNA。上游引物Ad1的序列为:5'-TTCCCCATGGCICAYAACAC-3'；下游引物Ad2的序列为:5'-CCCTGGTAKCCRATRTTGTA -3'，扩增片段长度为482bp。通过测序和序列分析进行基因分型。 B.8.2.3 病毒分离 B.8.2.3.1 细胞系 腺病毒40和41型能在Grahm293细胞、张氏结膜细胞和第三代食蟹猴肾细胞（tCMK）中生长。Grahm293细胞目前是腺病毒最敏感的细胞。 B.8.2.3.2 细胞培养基成分 DMEM培养液、青/链霉素（10000 U/mL，10000 μg/mL）、胎牛血清。 B.8.2.3.3 生长液 100 mLDMEM生长液中包含DMEM培养液89 mL、胎牛血清10 mL、青∕链霉素1 mL。 B.8.2.3.4 维持液 DMEM培养液。 B.8.2.3.5 试验步骤 取粪便上清液0.2 mL～0.5 mL，先加青/链霉素0.2mL4℃过夜处理或用0.45 μm除菌滤器过滤，接种到生长至80%单层细胞管，37℃吸附1h，弃去标本液，换上细胞维持液，置37℃孵育至出现细胞病变，按照上述方法在细胞内连续传代3次。肠腺病毒40/41型感染Grahm293细胞12 d后，细胞出现特征性病变，细胞肿胀变圆，成堆呈葡萄状。在传代培养第二代时10 d左右出现局灶性病变，15d后病变完全。
B.9 隐孢子虫检验 B.9.1 标本收集 粪便、呕吐物或小肠液按照常规方法收集，如不能及时进行检测，可放在4 ℃保存，存放不超过72h。 |
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