B.1.5 核酸检测 核酸检测包括DNA检测和RNA检测，RNA检测更能反映活菌状态。一般不宜直接对粪便原始标本进行沙门菌核酸检测（全基因组或Meta测序除外），增菌后利用增菌液或获得可疑菌落后进行核酸检测。通常利用经过评价的特异性及敏感性均较高的引物进行1个或多个沙门菌特异靶基因或核酸片段的扩增检测。可使用市售的检测规定片段的商品化试剂盒。推荐沙门菌属荧光PCR检测引物见表B.4。 表 B.4 沙门菌属核酸检测引物序列
B.2 致泻性大肠埃希菌检验 B.2.1 标本收集 采集病例急性期、未用抗生素前新鲜粪便、呕吐物标本（1g），尽快送检。运送时间超过2h时，标本应放入Cary-Blair运送培养基中，在冷藏条件下送检；或将粪便标本直接接种增菌培养基，室温条件下运送。 B.2.2 分离培养 B.2.2.1 直接分离培养 取新鲜粪便、呕吐物标本分别接种于麦康凯琼脂或伊红美蓝琼脂等对大肠埃希菌抑制性较弱的选择性鉴别培养基或其他商品化的培养基，36 ℃±1 ℃培养24 h。从平板上挑取可疑菌落（见表B.5）进行鉴定。 B.2.2.2 增菌培养 对疑似致泻性大肠埃希菌感染相关标本，可经大肠埃希菌肉汤（EC肉汤）增菌后接种麦康凯等选择性培养基；如疑似肠出血性大肠埃希菌O157:H7感染标本，经改良EC肉汤（mEC）增菌液增菌6h，可选用O157免疫磁珠对增菌液中的目标菌进行富集，增菌液或经免疫磁珠富集后的悬液接种于亚碲酸钾-头孢菌素-山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC）、O157显色培养基（如科玛嘉 O157）或山梨醇麦康凯琼脂。大肠埃希菌的呕吐物标本等先经营养肉汤于36 ℃±1 ℃增菌培养，待有菌生长后，挑取1～2接种环转种至弱选择性培养基上，36 ℃± 1℃培养24 h。从平板上挑取可疑菌落（见表B.5）进行鉴定。 表 B.5 大肠埃希菌在选择性琼脂平板上的菌落特征
B.2.3 致病型鉴定 B.2.3.1 肠致病性大肠埃希菌（EPEC） 疑似菌落符合下列特征鉴定为EPEC： a) 标本：水样或蛋花汤样便、呕吐物等； b) 革兰染色镜检及生化反应符合大肠埃希菌特征； c) 存在特异性紧密黏附素（intimin）基因 eae，但不含志贺毒素基因1和2（stx1 和stx2）； d) 典型 EPEC（typical EPEC，tEPEC）除含有 eae 基因外，还携带 EAF 质粒编码的束状菌毛基因bfp，而非典型 EPEC（atypical EPEC，aEPEC）不含 bfp 基因（见表 B.6）。 B.2.3.2 肠产毒性大肠埃希菌（ETEC） 疑似菌落符合下列特征鉴定为ETEC： a) 标本：霍乱样水样便、呕吐物等； b) 革兰染色镜检及生化反应符合大肠埃希菌特征； c) 存在特异性热不稳定肠毒素（heat-labile enterotoxin）基因 lt，猪源热稳定肠毒素（heat-stable enterotoxin）基因 stIa 或人源热稳定肠毒素基因 stIb 中的任何一种或以上（见表 B.6）。 B.2.3.3 肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC） 疑似菌落符合下列特征鉴定为EIEC： a) 标本：细菌性痢疾样便、呕吐物等； b) 革兰染色镜检为革兰阴性杆菌； c) 生化反应：不发酵或迟缓发酵乳糖，不产气，部分菌株无动力，酒石酸盐阴性，赖氨酸脱羧酶阴性； d) 存在特异性侵袭性质粒抗原 H（invasive plasmid antigen H）基因 ipaH（见表 B.6）； e) 进一步通过系统生化反应同志贺菌属相鉴别。 B.2.3.4 肠出血性大肠埃希菌（EHEC）/产志贺毒素大肠埃希菌（STEC） 疑似菌落符合下列特征鉴定为EHEC/STEC： a) 标本：早期为水样便，后为血便、呕吐物等； b) 革兰染色镜检为革兰阴性杆菌； c) 生化反应：不发酵或迟缓发酵山梨醇，赖氨酸、鸟氨酸、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖阳性，精氨酸、苦杏仁甙阴性； d) 存在特异性志贺毒素 1 基因（stx1）和/或志贺毒素 2 基因（stx2），统称为 STEC，部分菌株可携带 eae 基因（见表 B.6）； e) 血清群为 O26、O45、O103、O111、O121、O145 及 O157，同时携带 eae 基因的菌株，通常具有更强的致病性，更容易引起出血性肠炎及 HUS，通常称为 EHEC。 B.2.3.5 肠集聚性大肠埃希菌（EAEC） 疑似菌落符合下列特征鉴定为EAEC： a) 标本：水样便、黏液便、呕吐物等； b) 革兰染色镜检及生化反应符合大肠埃希菌特征； c) 存在特异性集聚黏附性菌毛调节基因 aggR； d) 部分非典型 EAEC（aggR 基因阴性）菌株，可检测特异性质粒编码的细菌外膜透性酶基因 aatA和染色体源性的 VI 型分泌系统蛋白基因 aaiC（见表 B.6）。 |
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