表 B.11 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌多重 PCR 鉴定参考序列
反应程序：95℃预变性5min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环后72 ℃延伸5min,4℃保存。 可使用市售的具有同等功效的商品化试剂盒进行鉴定。 B.4.4 菌种的判定和结果报告 根据B.4.3.1、B.4.3.2、B.4.3.3结果，报告是否检出空肠弯曲菌或结肠弯曲菌。腹泻病例同时感染空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的情况很常见。
B.5 小肠结肠炎耶尔森菌检验 B.5.1 标本的采集与运送 采集腹泻病人急性期、宜在抗生素应用以前的新鲜粪便2 g～5 g或2 mL～5 mL，粪便尽量选取有性状改变部分，置于干净广口容器内，立即送实验室进行检测。运送时间超过2 h者，标本应放入Cary-Blair运送培养基中，在4 ℃冷藏条件下48h内送达实验室；或将粪便标本直接接种到耶尔森菌改良PBS增菌培养基内，4 ℃冷藏条件下送达实验室。如不易获得粪便，可采用直肠拭子法采便：将棉拭子前端用无菌甘油或等渗盐水（0.9%氯化钠）浸润（棉拭子多余的液体贴管壁挤出），然后插入肛门4 cm～5 cm（幼儿约2 cm～3 cm）处，轻轻在直肠内旋转，于紧靠肛环边的隐窝处采集直肠表面黏液后取出，拭子放入可旋盖密封的离心管或含Cary-Blair培养基的离心管中或耶尔森菌改良PBS增菌培养基内，旋紧盖子以防水分丢失和漏洒。肛拭子运送条件同新鲜粪便。如果伴有发热，且外周血白细胞高的患者可同时采集全血进行血培养。 B.5.2 菌株分离培养方法 B.5.2.1 直接分离培养 将粪便标本直接接种于耶尔森菌选择性培养基（CIN培养基）或麦康凯（MAC）培养基等选择性琼脂上，25 ℃～28 ℃培养24 h～48 h。从培养基上挑取可疑菌落（在CIN培养基上为直径约1 mm～2 mm，中心呈深玫瑰红色，周围有窄透明环的“公牛眼”状菌落；在MAC培养基上为圆形、光滑、湿润、扁平略有凸起、半透明的菌落，中央有极淡的粉色的小菌落）接种于尿素培养基。分解尿素者进一步按本标准第B.5.2.3条进行生化鉴定。 血液标本直接接种血平板或LB平板，也可接种血培养瓶25 ℃～28 ℃培养24 h～48 h，对长出的菌落直接按照本标准第B.5.2.3条系统生化鉴定。 B.5.2.2 增菌培养 监测用标本或其他不需要在短时间内获得培养结果的样本，可采用长时间冷增菌的策略提高标本检出率。取约1 g粪便标本接种于10 mL改良磷酸盐缓冲液（改良PBS），于4 ℃分别增菌培养10 d和20 d后取增菌培养物接种于CIN、MAC等平板，25 ℃～2 8℃培养24 h～48 h，按照本标准第B.5.2.1条中的方法从平板上挑取可疑菌落进行分离培养。 B.5.2.3 生化鉴定 使用质量受到公认的生化鉴定试剂对筛选到的可疑菌落是否为小肠结肠炎耶尔森菌进行判断。目前部分商业化系统生化鉴定仪对部分小肠结肠炎耶尔森菌菌株无法给出准确鉴定结果。另外，使用商业质谱鉴定仪判断为非小肠结肠炎耶尔森菌的菌株并不能完全否定，仍要最终通过生化鉴定判断。 本菌主要生化反应情况见表B.12，各生化反应（除37℃条件下动力和VP试验）均在25 ℃～28 ℃进行。 表 B.12 典型小肠结肠炎耶尔森菌主要的生化反应情况
B.5.2.4 血清学检测 该菌具有O抗原，目前已经发现70种以上的血清型。使用分型抗血清或单克隆抗体通过玻片凝集法进行检测，设置盐水作为对照。国际上目前具有商业化试剂可进行检测的血清型为O:12、O:3、O:5、O:8、O:9型，我国小肠结肠炎耶尔森菌病病例常见菌株血清型别为O:3与O:9血清型。 B.5.3 核酸检测 使用商业化试剂盒提取病例标本DNA，进行小肠结肠炎耶尔森菌特异性基因foxA、ail的检测，引物序列见表B.13。 表 B.13 毒力基因 PCR 扩增引物序列
PCR反应体积为20μL，引物使用浓度为10 μmol/L，体系内上下游引物各加0. 5μL；Taq酶：1 U/20μl体系。同时设阴性、阳性及空白对照。 PCR反应程序：95 ℃预变性10 min；9 4℃变性15s，退火30s，72 ℃延伸30s。共25个循环。最后72 ℃延伸5min。 电泳及结果判断：PCR产物在1.5％琼脂糖上电泳，凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度分别如表中所述则判相应基因为阳性。 B.5.4 结果报告 从临床病例的粪便标本中分离到小肠结肠炎耶尔森菌或检测到小肠结肠炎耶尔森菌特异性基因foxA和（或）ail即可诊断为小肠结肠耶尔森菌感染。
B.6 轮状病毒检验 B.6.1 标本收集 B.6.1.1 粪便 收集病例早期腹泻粪便约10 g或10 mL，置无菌容器内。 B.6.1.2 血液标本 如做抗体测定，应采集2份血液标本。第1份(急性期)在发病时尽早采集，第2份在发病后1个月左右采集。无菌条件下抽取5 mL血液，置于消毒试管。室温放置2h，待凝固后分离血清。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
鄂公网安备42011102005941号