4 评价方法 在掌握3.1~3.8所列资料基础上，对微生物菌种按照以下方法开展安全性评价： a) 国内外安全性评价资料分析：对菌种国内、国外使用历史及安全性(包括但不限于其致病性和产毒能力报告、临床试验资料、科技文献或综述等)进行综合分析。若无上述资料，应对同种内其他株或在亲缘关系上与其相近种属菌种的使用历史和安全性评价资料(包括但不限于与该菌种的亲缘性关系说明、基因序列匹配度分析等)进行分析。 b) 全基因组测序：对菌种进行全基因组测序，分别获得其基因组框架图和完成图(藻类除外)，并对测序数据的毒力基因、耐药基因、毒素产生相关基因等进行综合分析。 c) 动物致病性试验：分别参照附录 A~附录 D 的方法或其他等效方法进行动物致病性试验，并对试验结果进行评价。 d) 耐药性试验：参照附录E中的方法或其他等效方法，对细菌菌种进行耐药性试验，同时结合全基因组测序获得的基因组完成图中耐药基因携带情况，进行综合评价。 e) 产毒试验：对细菌菌种，应对其基因组中产毒基因携带及表达情况进行综合分析与评价。若携带产毒基因且能表达，应参照生产条件进行包括生产用培养基在内的多种基质中(单品种固体、多品种固体复合、不同成分液体组合等)的产毒试验。产毒试验的培养时间应不短于1个产品生产周期，并按照食品安全国家标准规定的检验方法或其他等效方法进行毒素(或抗菌物质)含量(或活性)检测。 对真菌菌种，其产毒试验应参照附录 F 中的方法进行，并按照食品安全国家标准规定的检验方法或其他等效方法进行真菌毒素含量的测定。 放线菌产生的抗菌物质或藻类产生的藻类毒素应按照相应食品安全国家标准规定的检验方法或其他等效方法进行检验。 若产毒试验显示受试菌种产生毒素(或抗菌物质)，则应根据产生毒素(或抗菌物质)的水平，并结合人群对用该菌种生产食品的摄入量，评估其对人群健康的影响。 f) 毒理学试验：对国内外均无食用习惯的菌种，应进行急性经口毒性试验/致病性试验、3项遗传毒性试验、90天经口毒性试验、致畸试验和生殖毒性试验。仅在国外个别国家或国内局部地区有食用习惯的菌种，应进行急性经口毒性试验/致病性试验、3项遗传毒性试验、90天经口毒性试验;已在多个国家批准食用的菌种，可进行急性经口毒性试验/致病性试验、2项遗传毒性试验。其中，2项遗传毒性试验包括细菌回复突变试验和哺乳动物红细胞微核试验，3项遗传毒性试验按照 GB15193.1《食品安全国家标准 食品安全性毒理学评价程序》中规定的遗传毒性试验组合进行。 g) 其他活性物质测定：直接添加到供1岁以下婴儿食用食品中的菌种，还应按照食品安全国家标准规定的检验方法或其他等效方法进行 D-乳酸的测定。 具有溶血活性或可产生其他代谢产物的菌种，还应按照食品安全国家标准规定的检验方法或其他等效方法进行溶血活性物质或相关代谢产物的测定。
5 结果判定 5.1 致病性及产毒能力完全符合以下3种情况者认为该菌种是安全的： a) 全基因组序列分析结果显示不存在已知的毒力/致病相关基因或毒素合成关键基因;或存在可能与致病相关的基因，但根据菌种的功能特性及文献资料排除该基因与宿主致病相关。 b) 动物试验显示无致病性。 c) 产毒试验结果显示在受试的所有基质中均不产生已知的、危害人类健康的活性代谢产物。 5.2 全基因组序列中发现含有已知毒力/致病基因或毒素合成关键基因，但动物试验显示不具有致病性，或产毒试验显示在受试的培养基中可产生已知的有毒活性代谢产物但水平较低，评估结果表明长期摄入对人体健康无影响，结合国内外安全使用历史，可认为该菌种是安全的。 5.3 全基因组测序结果显示存在已知毒力/致病或毒素合成关键基因，且动物试验显示具有致病性或产生高水平已知的有毒代谢产物，长期摄入可能影响人体健康，认为该菌种是不安全的。 5.4 以下耐药性的判定原则仅适用于5.1及5.2中已确认为安全的细菌菌种： a) 对受试抗菌药物无耐药性，表现为菌种对1种或几种受试抗菌药物的 MIC 值低于设定的阈值，且全基因组序列中未检测到与耐药表型直接相关的耐药基因，或检测到与耐药表型直接相关的耐药基因但经试验证实其不介导耐药，则认为该菌种是安全的。 b) 对受试抗菌药物具有固有耐药性，表现为菌种对1种或几种受试抗菌药物的 MIC值高于设定的阈值，且其携带的耐药基因位于染色体上，通过水平传播的可能性很小，认为该菌种是安全的。 c) 对受试抗菌药物产生获得性耐药，表现为菌种对1种或几种受试抗菌药物的 MIC值高于设定的阈值，若产生耐药的机制是染色体突变所致，其水平传播的可能性很低，一般认为该菌种是安全的。 d) 菌种对1种或几种抗菌药物的 MIC值高于设定的阈值，若全基因组测序分析结果显示耐药决定子位于可移动遗传元件上，具有水平传播的潜力，则认为该菌种是不安全的。 e) 若该菌种基因组中存在对世界卫生组织关于人类医学至关重要抗菌药物和高度重要抗菌药物列表中规定的抗生素耐药基因，则应结合其 MIC值进行综合判定： ———若 MIC值高于设定的阈值，则认为该菌种是不安全的; ———若 MIC值低于设定的阈值，则应评估该耐药基因表达的可能性，若能表达，则认为该菌种是不安全的。 |
